Marcadores Moleculares de ADN y Sanidad de Bovinos de leche
MARCADORES MOLECULARES DE ADN Y SU APLICACIÓN EN SANIDAD DE RODEOS LECHEROS
Resumen
El conocimiento del genoma bovino y la utilización de marcadores de ADN ha permitido conocer el origen de determinadas enfermedades hereditarias y desarrollar técnicas de diagnostico precoz.
Mediante el aislamiento de ADN a partir de muestras de sangre, semen, pelo, etc. y aplicando técnicas de PCR-RFLP (amplificación y cortes con enzimas de restricción específicos de secuencias de ADN) podemos diagnosticar si un animal es portador de un gen letal o mutante para determinadas características. En la actualidad podemos estudiar enfermedades hereditarias del bovino de leche como: BLAD (deficiencia en la adhesión leucocitaria bovina) que produce mortalidad en terneros por una baja de inmunidad, DUMPs (deficiencia de la enzima uridina-monofostato sintasa) que produce una disminución en la tasa de no retorno al servicio por mortalidad embrionaria, Citrulinemia bovina (deficiencia de la enzima argininosuccinato sintasa) que produce mortalidad en terneros con sintomatología de depresión de sistema nervioso, CVM (complejo vertebral de malformación), pie de mula, carácter bulldog, hernia umbilical, etc. En el laboratorio del Área Genética de la Facultad de Veterinaria nos encontramos desarrollando un Proyecto en el que uno de sus objetivos plantea el estudio de enfermedades monogénicas en bovinos de la raza Holando-Uruguayo. Dentro de las enfermedades hereditarias estudiadas por técnicas de ADN en nuestro País hemos detectado la presencia del gen mutante para la enfermedad BLAD en reproductores de esta raza. Si bien la frecuencia de estos genes mutantes es baja, debemos tener en cuenta que la utilización masiva de determinados reproductores portadores puede incrementarla y así generar importantes perdidas económicas. Por otro lado el conocer si un reproductor esta libre de una enfermedad hereditaria permite desde el punto de vista económico generar un valor agregado a su producto (semen, embriones). Por estos motivos en diversos países se han implementado programas de vigilancia para enfermedades genéticas; de aquí la importancia de divulgar a los colegas veterinarios y productores la utilización e importancia de los marcadores moleculares de ADN en sanidad animal.
Introducción
En la década pasada los avances tecnológicos ocurridos en el campo de la genética molecular y la informática (bioinformática, bancos de genes de dominio publico) han permitido la identificación de genes relacionados con desordenes hereditarios de importancia en el ganado lechero. En la mayoría de los casos la presencia de mutaciones simples en estos genes produce la formación de variantes proteicas no funcionales ocasionando importantes alteraciones en el desarrollo y metabolismo de los animales. En este tipo de alteraciones los animales portadores de variantes génicas mutadas no presentan alteraciones pero si las trasmiten a su descendencia aumentando de esa forma la probabilidad del desarrollo de enfermedades hereditarias con repercusión en el ámbito económico. Debemos tener en cuenta que un toro elite seleccionado como reproductor puede llegar a tener mediante las técnicas de reproducción asistida una descendencia estimada de 10.000 hijos y 100.000 nietos, de aquí se desprende la importancia del control de enfermedades hereditarias.
Las estrategias para él diagnostico genético se pueden clasificar en dos grupos: directas e indirectas. En las directas el marcador molecular utilizado puede ser la identificación de la mutación en el gen asociado a la patología.
Los protocolos de diagnostico directo comprenden los siguientes pasos:
- Extracción de ADN a partir de muestras biológicas (sangre extraída con anticoagulante, semen, tejidos, leche, etc.),
- amplificación (por técnica de PCR) de la secuencia de ADN que contiene el sitio donde ocurre la mutación,
- tratamiento de la secuencia amplificada con la enzima de restricción que cortan la secuencia normal (RFLP)
- electroforesis en geles de agarosa para observación del numero y tamaño de los fragmentos de ADN,
- análisis y genotipado para determinar si el animal es normal, portador o afectado.
El diagnóstico indirecto es independiente del conocimiento del gen implicado en la patología y se fundamenta en la herencia conjunta o estrechamente ligada del marcador molecular de ADN con el gen de interés. En estos casos el marcador molecular puede ser una secuencia repetida polimórfica (microsatélite) realizándose el estudio de cosegregaciòn entre la patología y dicho marcador.
El desarrollo de los mapas genéticos comparativos entre especies ha permitido avanzar en el conocimiento de patologías en mamíferos. En el presente año un total de 1564 genes y secuencias que se expresan (marcadores tipo I) y 349 microsatélites (marcadores tipo II) han sido mapeados en el bovino. La rapidez con que avanza la tecnología genética en este campo ha permitido a investigadores norteamericanos anunciar y difundir la secuenciación completa del genoma de un bovino de raza Hereford.
Resumen
El conocimiento del genoma bovino y la utilización de marcadores de ADN ha permitido conocer el origen de determinadas enfermedades hereditarias y desarrollar técnicas de diagnostico precoz.
Mediante el aislamiento de ADN a partir de muestras de sangre, semen, pelo, etc. y aplicando técnicas de PCR-RFLP (amplificación y cortes con enzimas de restricción específicos de secuencias de ADN) podemos diagnosticar si un animal es portador de un gen letal o mutante para determinadas características. En la actualidad podemos estudiar enfermedades hereditarias del bovino de leche como: BLAD (deficiencia en la adhesión leucocitaria bovina) que produce mortalidad en terneros por una baja de inmunidad, DUMPs (deficiencia de la enzima uridina-monofostato sintasa) que produce una disminución en la tasa de no retorno al servicio por mortalidad embrionaria, Citrulinemia bovina (deficiencia de la enzima argininosuccinato sintasa) que produce mortalidad en terneros con sintomatología de depresión de sistema nervioso, CVM (complejo vertebral de malformación), pie de mula, carácter bulldog, hernia umbilical, etc. En el laboratorio del Área Genética de la Facultad de Veterinaria nos encontramos desarrollando un Proyecto en el que uno de sus objetivos plantea el estudio de enfermedades monogénicas en bovinos de la raza Holando-Uruguayo. Dentro de las enfermedades hereditarias estudiadas por técnicas de ADN en nuestro País hemos detectado la presencia del gen mutante para la enfermedad BLAD en reproductores de esta raza. Si bien la frecuencia de estos genes mutantes es baja, debemos tener en cuenta que la utilización masiva de determinados reproductores portadores puede incrementarla y así generar importantes perdidas económicas. Por otro lado el conocer si un reproductor esta libre de una enfermedad hereditaria permite desde el punto de vista económico generar un valor agregado a su producto (semen, embriones). Por estos motivos en diversos países se han implementado programas de vigilancia para enfermedades genéticas; de aquí la importancia de divulgar a los colegas veterinarios y productores la utilización e importancia de los marcadores moleculares de ADN en sanidad animal.
Introducción
En la década pasada los avances tecnológicos ocurridos en el campo de la genética molecular y la informática (bioinformática, bancos de genes de dominio publico) han permitido la identificación de genes relacionados con desordenes hereditarios de importancia en el ganado lechero. En la mayoría de los casos la presencia de mutaciones simples en estos genes produce la formación de variantes proteicas no funcionales ocasionando importantes alteraciones en el desarrollo y metabolismo de los animales. En este tipo de alteraciones los animales portadores de variantes génicas mutadas no presentan alteraciones pero si las trasmiten a su descendencia aumentando de esa forma la probabilidad del desarrollo de enfermedades hereditarias con repercusión en el ámbito económico. Debemos tener en cuenta que un toro elite seleccionado como reproductor puede llegar a tener mediante las técnicas de reproducción asistida una descendencia estimada de 10.000 hijos y 100.000 nietos, de aquí se desprende la importancia del control de enfermedades hereditarias.
Las estrategias para él diagnostico genético se pueden clasificar en dos grupos: directas e indirectas. En las directas el marcador molecular utilizado puede ser la identificación de la mutación en el gen asociado a la patología.
Los protocolos de diagnostico directo comprenden los siguientes pasos:
- Extracción de ADN a partir de muestras biológicas (sangre extraída con anticoagulante, semen, tejidos, leche, etc.),
- amplificación (por técnica de PCR) de la secuencia de ADN que contiene el sitio donde ocurre la mutación,
- tratamiento de la secuencia amplificada con la enzima de restricción que cortan la secuencia normal (RFLP)
- electroforesis en geles de agarosa para observación del numero y tamaño de los fragmentos de ADN,
- análisis y genotipado para determinar si el animal es normal, portador o afectado.
El diagnóstico indirecto es independiente del conocimiento del gen implicado en la patología y se fundamenta en la herencia conjunta o estrechamente ligada del marcador molecular de ADN con el gen de interés. En estos casos el marcador molecular puede ser una secuencia repetida polimórfica (microsatélite) realizándose el estudio de cosegregaciòn entre la patología y dicho marcador.
El desarrollo de los mapas genéticos comparativos entre especies ha permitido avanzar en el conocimiento de patologías en mamíferos. En el presente año un total de 1564 genes y secuencias que se expresan (marcadores tipo I) y 349 microsatélites (marcadores tipo II) han sido mapeados en el bovino. La rapidez con que avanza la tecnología genética en este campo ha permitido a investigadores norteamericanos anunciar y difundir la secuenciación completa del genoma de un bovino de raza Hereford.
Enfermedades hereditarias de interés en bovinos de leche:
DUMPS (deficiencia de la enzima uridina-monofostato sintasa): enfermedad hereditaria metabólica que contribuye a aumentar la tasa de retorno al servicio estando dentro de las causas hereditarias del síndrome vaca repetidora de servicio. El gen que codifica para esta enzima se encuentra mapeado en el cromosoma BTA1 del bovino y el cambio de una base nucleotidica (C-T) produce un alelo mutado que genera un codòn stop con terminación prematura de la cadena polipeptídica. Los embriones que heredan los dos alelos mutados carecen de esta enzima y no pueden seguir con su desarrollo normal. Los ancestros identificados como portadores de la enfermedad provienen de dos líneas: Toro Happy-Herd Beautician y Needle-Lane Jon Red.
BLAD (deficiencia en la adhesión leucocitaria bovina): enfermedad hereditaria que contribuye a aumentar la tasa de mortalidad en terneros. Estos mueren entre los 2 a 8 meses de vida con sintomatología clínica inespecífica (enteritis, falta de cicatrización de heridas, neumonías, estomatitis ulcerativas, etc. Existe una baja en las defensas inmunitarias producto de una mutación puntual en el gen CD18. En nuestro País utilizando él diagnostico con marcadores de ADN sobre una muestra de 138 bovinos Holando se encontró que el 7.2% eran portadores de esta patología.
CITRULINEMIA (deficiencia de la enzima argininosuccinato sintasa): Enfermedad recesiva letal metabólica en la cual la falta de esta enzima en doble dosis produce la muerte de los terneros (durante la primer semana de vida) con sintomatología clínica de intoxicación por hiperamonemia y depresión del sistema nervioso. Uno de los toros portadores y diseminadores en la raza Holstein es Linmack Kriss King. El gen que codifica para esta enzima se encuentra mapeado en el cromosoma BTA11 y dicha patología se genera por la presencia de una mutación puntual permitiendo diseñar un diagnostico molecular directo por PCR-RFLP.
BLAD (deficiencia en la adhesión leucocitaria bovina): enfermedad hereditaria que contribuye a aumentar la tasa de mortalidad en terneros. Estos mueren entre los 2 a 8 meses de vida con sintomatología clínica inespecífica (enteritis, falta de cicatrización de heridas, neumonías, estomatitis ulcerativas, etc. Existe una baja en las defensas inmunitarias producto de una mutación puntual en el gen CD18. En nuestro País utilizando él diagnostico con marcadores de ADN sobre una muestra de 138 bovinos Holando se encontró que el 7.2% eran portadores de esta patología.
CITRULINEMIA (deficiencia de la enzima argininosuccinato sintasa): Enfermedad recesiva letal metabólica en la cual la falta de esta enzima en doble dosis produce la muerte de los terneros (durante la primer semana de vida) con sintomatología clínica de intoxicación por hiperamonemia y depresión del sistema nervioso. Uno de los toros portadores y diseminadores en la raza Holstein es Linmack Kriss King. El gen que codifica para esta enzima se encuentra mapeado en el cromosoma BTA11 y dicha patología se genera por la presencia de una mutación puntual permitiendo diseñar un diagnostico molecular directo por PCR-RFLP.
En la Figura vemos un gel de agarosa donde en animales homocigotas dominantes (normales) se observan dos bandas despues de realizar el corte con la enzima de restricción (1,2,3,4 color amarillo).
CVM (Complejo de malformación vertebral): Patología hereditaria que se manifiesta con abortos y nacimiento de terneros prematuros (antes del día 260) con alteraciones importantes del desarrollo a nivel de columna vertebral, miembros, malformaciones del tracto digestivo y corazón.
Se observan terneros con fusiones de vértebras, flexión de carpo, enanismo proporcionado.
En este tipo de enfermedades autosómicas recesivas si se cruza un toro portador con una hembra portadora obtenemos el 75% de la progenie normal (25% normal y 50% normal portadora) y un 25% enferma. El estudio de pedigríes permitió conocer que dicha mutación se origino en un toro que es el mismo que trasmitió el BLAD a nivel mundial (7H0543 Carlin-M Ivanhoe Bell BL). Otros reproductores que han contribuido a la diseminación de esta patología son: 7H02236 Emprise Bell Elton BL y Southwind Bell of Bar Lee. El diagnóstico molecular para esta enfermedad se encuentra patentado en Europa y Estados Unidos por laboratorios privados.
Simbología utilizada en los catálogos de reproductores
Enfermedad hereditaria
BL- Portador de BLAD
TL- Libre de BLAD
CV- Portador CVM
TV- Libre de CVM
DP- Portador de DUMPS
TD- Libre de DUMPS
BD- Portador del gen Bulldog
MF- Portador de Pie de mula
BIBLIOGRAFÍA
-Everts-van der Wind, A; et al. (2004). A 1463 Gene cattle-human comparative map with anchor points defined by human genome sequence coordinate. Genome Reseach 14: 1424-1497 (www.genome.org).
-Llambi, S y Arruga. (2002). Genes, cromosomas y fertilidad en bovinos. Albéitar. 60:36-39 (Publicación para veterinarios y técnicos del sector de animales de producción, España).
-Llambì, S et al. (2003). Frequencia da deficiencia na adesao leucocitaria em uma populacao de bovinos da raca holandesa, no Uruguai. ARS VETERINARIA, Vol. 19, Nº1:52-56.
-Rincón, G. (2002). Aplicación de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) en sanidad, producción y reproducción animal. 41-48. Curso Posgrado Veterinaria-Pedeciba. Facultad de Veterinaria-UdelaR. Dep. Legal 328831.
Direcciones de Internet
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/cow/
http://www.cgd.csiro.au/
http://www.genome.gov/12512900
http://www.holsteinusa.com/
http://www.holsteinworld.com/
Conferencia presentada en Seminario "Leche y Productos lácteos aspectos moleculares y tecnológicos" 4-5 Noviembre 2004- Facultad de Agronomía-UdeLAR-Uruguay
posted by Dra.PhD Silvia Llambí Dellacasa at 3:46 p. m.
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