Blog de la Dra. PhD Silvia Llambí Dellacasa destinado a la difusión de información sobre enfermedades hereditarias en rumiantes. Prof. Adjunto Area Genética-Facultad de Veterinaria-UdeLAR-Uruguay. e.mail: silvia.llambi@gmail.com

28 junio 2005

Freemartinismo en bovinos



En la foto observamos dos terneras Holando freemartins con la vellosidad seudoprepucial característica.



Quimerismo XX/XY (Síndrome de Freemartinismo en bovinos).
La frecuencia de partos dobles en bovinos (mellizos) varía de acuerdo a la raza y a los rodeos. Estudios realizados en 16 razas bovinas estiman un rango de frecuencia entre el 0. 51% al 5. 62%. En razas de carne la frecuencia se estima en un 1% mientras que en ganado de leche sería del 4-5%. De ellos se estima que un 95% son mellizos dicigóticos, mientras que un 5% serían gemelos monocigóticos. Los partos múltiples (trillizos, cuatrillizos, etc.) son poco frecuentes. En la raza Friesian Israelí, cuando se estudian rodeos pequeños (nº total de animales = 35. 486) se observa un 3. 91% de partos dobles, mientras que cuando se estudian rodeos grandes (nº total de animales = 105. 597) se observa un 5. 62%, encontrándose una dependencia entre el tamaño del rodeo y el porcentaje de mellizos (David, 1976; Hámori, 1983). En bovinos el desarrollo simultáneo de dos o más embriones en el útero materno posibilita la fusión de las membranas fetales con formación de anastomosis vasculares a nivel del alanto-córion. Dichas anastomosis permiten intercambiar en forma bidireccional elementos formes (células) y sustancias humorales (hormonas) entre los fetos. De acuerdo a la revisión realizada por Romagnano et al. (1988) la ocurrencia de fusiones alanto-coriónicas se estiman en un 92% de los casos, dando lugar a uno de los intersexos gonadales más comunes en bovinos; las llamadas hembras Freemartin. Por lo tanto, podemos definir una hembra Freemartin como un animal estéril nacido mellizo de por lo menos un M (intersexo gonadal). Fenotípicamente en los primeros meses de vida, la apariencia y los genitales externos de una freemartin indican sexo femenino. En algunos casos puede presentarse un abundante penacho piloso en el vértice de la comisura vulvar como signo masculinizante (pilosidad seudoprepucial) (Grunert y Berchtold, 1988). A nivel de los órganos reproductores internos se observan distintos grados de subdesarrollo (vaginas ciegas, ovarios hipoplásicos, agenesia total o parcial de cuernos uterinos, etc.) o bien puede observarse desarrollo de órganos reproductores masculinos (epidídimos, vesículas seminales, tejido testicular, etc.) (Wilkes et al., , 1981). A medida que la edad de estas hembras aumenta, se puede observar un cambio conformacional del cuerpo que la lleva a presentar aspecto de macho (características externas:tabla del cuello ancha, predominancia del diámetro torácico sobre el abdominal, escaso desarrollo mamario, etc.). En esta etapa el clítoris puede hipertrofiarse llegando a adquirir el tamaño y la forma de un pequeño pene (Bonnevaux y Baptista, 1982; Grunert y Berchtold, 1988). Desde el punto de vista etimológico la palabra Freemartin deriva del inglés: a) "Free" que se refiere a una hembra estéril, no lactante, ni preñada con características de toro o buey; b) "Martin", referido al 11 de noviembre (día de San Martin) en el cual se sacrifican entre otros, animales con problemas reproductivos, almacenándose dicha carne para la temporada de invierno (Forbes, 1946). La primera evidencia anatómica de una hembra Freemartin es presentada por Valsalva y Baglivi en el año 1692 (citado por Marcum, 1974). En 1779, John Hunter realiza el estudio detallado del aparato reproductor de tres animales a los cuales considera freemartin, asociando por primera vez la patología encontrada en dichas hembras con el hecho de ser mellizas de machos. Scarpa (1784) describe al freemartin como un animal con órganos reproductores internos exclusivamente masculinos y órganos reproductores externos exclusivamente femeninos.Posteriormente Numan (1843) realiza un exhaustivo trabajo donde considera a los freemartin como M o H con órganos reproductivos defectuosos, no considerándolos como hermafroditas. Por otro lado Monell (1846) y Spiegelberg (1861) encuentran parejas de mellizos heterocigotas donde la H se presenta normal desde el punto de vista reproductivo. Es a principios del presente siglo donde estudios más profundos comienzan a responder interrogantes sobre este fenómeno biológico. En 1911, Tandler y Keller estudian las membranas placentarias de 17 pares de mellizos heterosexuales (H/M) encontrando: a) un corion común entre los mellizos; b) presencia de anastomosis vasculares reveladas mediante inyección de sustancias en la arteria umbilical de uno de los fetos y pasaje de las mismas al mellizo; c) ausencia de anastomosis vascular en un caso donde la pareja de mellizos (H/M) presentaba desarrollo normal de los aparatos reproductores; d) presencia de dos cuerpos lúteos en los ovarios maternos, indicando la condición dicigótica de los mellizos. Entre los años 1916 y 1917, Lillie examina 55 pares de mellizos "in utero", y los ovarios correspondientes encontrando la presencia de dos cuerpos lúteos, apoyando de esta manera la condición dicigótica de los mellizos. Dicho investigador observa la presencia de anastomosis vasculares entre los fetos cuando el tamaño de los mismos se encuentra entre los 19 y 20 mm. Realizando cortes histológicos de los órganos de fetos, cuando éstos tienen un tamaño de 7. 5 a 28 cm observa que el desarrollo de los conductos de Wolff se ve favorecido, mientras que el de los conductos de Muller se ve inhibido. De sus estudios concluye que un Freemartin es una hembra genética que sufre modificaciones en su organismo por hormonas sexuales aportadas tempranamente por el mellizo macho; sugiriendo el pasaje de las mismas a través de la circulación vascular común durante la vida fetal (teoría hormonal). Por otro lado, Chapin (1917) realiza un estudio microscópico del aparato reproductor de varios fetos freemartin llegando a la conclusión que los órganos que se encuentran en estado indiferenciado en el freemartin, van a desarrollarse hacia un estado masculino debido al estímulo de las secreciones hormonales del co-mellizo M, mientras que aquellos órganos que habían comenzado su diferenciación normal como órganos femeninos van a verse retrasados o inhibidos en su desarrollo. Dicha autora propone que la variación encontrada en el desarrollo o tipo de órganos del freemartin va a estar correlacionada con el grado de anastomosis existente así como con el tiempo, en días, en el cual la secreción hormonal del co-mellizo va a entrar en la circulación de la H. Los estudios realizados por Tandler y Keller (1911), Lillie (1916, 1917) y Chapin (1917) permiten descartar la hipótesis propuesta por Hart (1909, 1912) en la cual expresa que un Freemartin es un macho con anormalidades del tracto reproductor, nacido mellizo en condición monocigótica (Marcum, 1974). El intercambio de sustancias hormonales y células mediados por las anastomosis vasculares entre fetos va a traer aparejado la llamada "teoría celular del síndrome de freemartinismo". Esta teoría comienza a gestarse en el año 1945 con las investigaciones realizadas por Owen (1945) sobre tipificación de antígenos eritrocitarios de membrana. Dicho autor, encuentra una relación fenotípica similar en las parejas de mellizos debida al quimerismo eritrocitario. Se entiende por quimera celular aquel individuo que presenta poblaciones celulares distintas provenientes de cigotos diferentes (Chu et al., 1964). Esta teoría celular es reafirmada con los trabajos realizados por Ohno et al., ( 1962, 1965) que comprueban la presencia de quimerismo de los cromosomas sexuales en diversos tejidos y órganos (tejido gonadal, médula ósea, hígado) de los freemartins y sus co-mellizos, en la raza Holstein-Friesian. Además, observan quimerismo XX/XY en células de la línea germinal de testículos de toros co-mellizos y a nivel de las células precursoras sanguíneas de ambos mellizos. Estos investigadores realizan uno de los primeros análisis del número de placas metafásicas de células XX/XY, encontrando que el libre intercambio de células precursoras sanguíneas no se realizaba en la proporción esperada 1:1 (entre células donantes y células húesped), dentro de cada pareja de mellizos. En 1962 la teoría célular sufre un quebranto con las investigaciones de Makino et al., ya que ellos no encuentran quimerismo XX/XY al realizar estudios citogenéticos en freemartins mediante la técnica de cultivo de leucocitos y cultivo de células de pulmón. A partir del año 1963, los trabajos de Fechheimer et al. confirman que los freemartins y co-mellizos son quimeras celulares XX/XY, postulando que la condición de intersexo está directamente relacionada con la presencia del cromosoma Y en la etapa fetal del desarrollo de la H. En 1965, Makino et al. amplían los estudios realizados en 1962, y encuentran quimerismo XX/XY en tejidos derivados del mesodermo y del endodermo. Estos estudios son complementados por Muramoto et al. (1965) encontrando quimerismo en 6 pares de mellizos heterosexuales. Los tejidos analizados por dichos autores fueron sangre, gónadas, riñon e hígado (de origen mesodérmico), pulmón (origen endodérmico) y piel (origen ectodérmico). En este último tejido no encuentran quimerismo XX/XY. Ellos observan que dentro de cada pareja de mellizos existe una gran variación en cuanto a la proporción de células quiméricas según los tejidos analizados. A mediados de la década del 60 y durante la década del 70 numerosos grupos investigan el quimerismo leucocitario XX/XY en las parejas de mellizos heterosexuales encontrando un paralelismo entre los porcentajes de células XY de las freemartins con respecto a los co-mellizos (Basrur y Kanagawa., 1969; Darré et al., 1972 ; Jost et al.,1972). Marcum et al. (1972) realizan un análisis estadístico de dicho paralelismo encontrando una alta correlación positiva (r=0. 97) entre el porcentaje de células XY de H quiméricas con el porcentaje de células XY de los M co-mellizos de éstas. Esto quiere decir que si una H freemartin presenta un 25 % de células XY en cultivos leucocitarios, el M co-mellizo presentará también un 25 % de células XY (Eldridge, 1985). Por otro lado, Wilkes et al. (1981) estudian la distribución de células XY en cultivos linfocitarios de 19 pares de mellizos heterosexuales y los relacionan con 117 casos citados en la literatura, encontrando una distribución azarosa del porcentaje de células XY, en un rango entre el 2% a un 96%. Estos autores discuten la importancia de dicha distribución en lo que hace al diagnóstico citogenético, ya que una H freemartin con bajo porcentaje de células XY es tan infértil e improductiva como una freemartin con alto porcentaje de células XY. También realizan cultivos celulares de distintos órganos (gónadas, pulmón, bazo, piel, riñón) y, de 41 cultivos, encuentran en 8 la presencia de quimerismo XX/XY (en bazo, gónadas y pulmón) con un rango del 2%. Estas diferencias entre la variación del quimerismo celular según el órgano o tejido, la explican como una posible contaminación de células leucocitarias en los cultivos mencionados. Esto trae como consecuencia la revisión en cuanto a si un freemartin y co-mellizo son quimeras secundarias (quimerismo celular en uno o pocos tejidos del cuerpo) o si son quimeras primarias (quimerismo en todas las células del cuerpo) (Wilkes et al., 1981).




En la foto observamos el quimerismo (células XX/XY) en un cultivo de linfocitos de una hembra fremartin.

La evidencia de células de la línea germinal XX a nivel de testículo (Ohno et al., 1962) trajo aparejado una serie de trabajos donde se discuten por un lado la fertilidad de los toros co-mellizos de H, y por otro la posible desviación de la proporción sexual 1:1 en la descendencia de dichos M. Esta última se vería favorecida hacia una progenie con mayor número de H. Como consecuencia de los estudios mencionados se propusieron dos hipótesis: 1) las células germinales XX localizadas en los testículos del toro, favorecerían un exceso de producción de espermatozoides portadores de cromosoma sexual X y por ende una desviación de la proporción sexual, con un mayor número de hembras en la progenie; 2) las células germinales localizadas en los testículos no serían viables puesto que degenerarían y por ende la fertilidad de los machos se vería reducida (Long, 1979). En cuanto a la primer hipótesis, estudios poblacionales realizados en centros de inseminación artificial donde se utilizaron toros quiméricos no revelaron la existencia de una desviación significativa de la proporción sexual 1:1 en la progenie de los mismos (Gustavsson, 1977; Kosaka et al., 1969). A pesar de estos estudios otros investigadores han reportado en forma individual, casos en los cuales toros quiméricos producían un exceso de H en su progenie (Dunn et al., 1968 ; Giovanni y Molteni , 1976). En cuanto a la segunda hipótesis, existen trabajos poblacionales en los cuales se evalúa la fertilidad de toros quiméricos en función de la calidad seminal y parámetros reproductivos, no encontrándose diferencias significativas en cuanto a fertilidad cuando se comparan con toros nacidos de parto único (Gustavsson, 1977; Valle-Filho et al., 1983). Estos resultados se contraponen con los encontrados por Dunn et al. (1979) cuando, estudiando la calidad seminal y performance reproductiva de 12 toros quiméricos encuentran que 7 (58. 3%) de ellos presentaban baja performance reproductiva así como focos de degeneración testicular. En los últimos años, las técnicas de la biología molecular como la utilización de marcadores genéticos hipervariables (fingerprinting) y la amplificación de secuencias nucleotídicas mediante la reacción en cadena de la ADN polimerasa (PCR) han permitido profundizar en el estudio de la teoría celular del freemartinismo. La utilización de sondas como: pÓ3'HVR64, pINS310, pEFD134. 7, pSRC-7 han permitido comprobar la presencia de quimerismo en muestras de ADN sanguíneo de ambos mellizos dicigóticos (igual patrón de bandas de fingerprinting). Estas mismas sondas aplicadas sobre ADN extraído de biopsias de piel de las mismas parejas pudo evidenciar patrones distintos de fingerprinting para cada integrante de la pareja. Estos resultados estarían apoyando la teoría celular de quimerismo secundario . Dicha teoría propone que el quimerismo se establece sólo a nivel sanguíneo, mientras que en otros tejidos del organismo cada integrante de la pareja presenta su genotipo real (Grobet et al., 1991; Plante et al., 1992). El dimorfismo sexual en mamíferos tiene su base genética en la constitución de los cromosomas sexuales X e Y. El cromosoma Y representa un 0. 5% del genoma diploide del bovino ( 7 X 10 9 bp) (Matthews y Reed, 1991). La utilización de secuencias específicas del cromosoma Y así como secuencias nucleotídicas de los cromosomas sexuales X/Y han permitido identificar la presencia de quimerismo s y aneuploidías de los cromosomas sexuales. En humanos, Mutter et al. (1991) mediante la utilización de la técnica de PCR han podido cuantificar genes como el ZFX/ZFY que se encuentran ligados en los cromosomas sexuales X e Y. Esta cuantificación ha llevado a la identificación de desbalances de los cromosomas sexuales permitiendo complementar la información obtenida por las técnicas convencionales de citogenética. Mediante la técnica de PCR, Aasen y Medrano (1990) lograron la amplificación en bovinos de los genes ZFX/ZFY. Estos productos de amplificación mostraron un polimorfismo en el largo de los fragmentos de restricción (RFLP) pudiéndose identificar el gen ZFX del ZFY. Por otro lado, Setiabudi (1993), utilizando el juego de primers BRY. 1, consigue amplificar un segmento nucleotídico específico del cromosoma Y bovino de 307 pb de ADN extraído a partir de muestras sanguíneas de 9 H freemartin.




En la foto se observa el gel de agarosa con el resultado del diagnóstico por PCR en muestras de ADN extraídas de sangre de hembras freemartins y sus comellizos machos.en el carril B y E se observa la banda de 307 pb como resultado positivo de que estas hembras son químeras y tienen secuencias del cromosoma Y ,en el carril D el resultado es negativo ya que se trata de una muestra de ADN de una hembra fértil y normal (madre de las parejas de mellizos), los carriles C y F corresponden a muestras de ADN de los machos mellizos, el carril G es un control negativo y en A y H tenemos marcadores de peso molecular.

3 Comments:

Blogger victor garcia said...

mui buena informacion

1:03 a. m.

 
Blogger Chica Panda said...

Excelente, fue de mucha ayuda. Gracias.

11:30 a. m.

 
Blogger Chica Panda said...

Excelente, fue de mucha ayuda. Gracias.

11:30 a. m.

 

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