Blog de la Dra. PhD Silvia Llambí Dellacasa destinado a la difusión de información sobre enfermedades hereditarias en rumiantes. Prof. Adjunto Area Genética-Facultad de Veterinaria-UdeLAR-Uruguay. e.mail: silvia.llambi@gmail.com

07 mayo 2005

Marcadores Moleculares de ADN y Sanidad de Bovinos de leche




MARCADORES MOLECULARES DE ADN Y SU APLICACIÓN EN SANIDAD DE RODEOS LECHEROS

Resumen

El conocimiento del genoma bovino y la utilización de marcadores de ADN ha permitido conocer el origen de determinadas enfermedades hereditarias y desarrollar técnicas de diagnostico precoz.
Mediante el aislamiento de ADN a partir de muestras de sangre, semen, pelo, etc. y aplicando técnicas de PCR-RFLP (amplificación y cortes con enzimas de restricción específicos de secuencias de ADN) podemos diagnosticar si un animal es portador de un gen letal o mutante para determinadas características. En la actualidad podemos estudiar enfermedades hereditarias del bovino de leche como: BLAD (deficiencia en la adhesión leucocitaria bovina) que produce mortalidad en terneros por una baja de inmunidad, DUMPs (deficiencia de la enzima uridina-monofostato sintasa) que produce una disminución en la tasa de no retorno al servicio por mortalidad embrionaria, Citrulinemia bovina (deficiencia de la enzima argininosuccinato sintasa) que produce mortalidad en terneros con sintomatología de depresión de sistema nervioso, CVM (complejo vertebral de malformación), pie de mula, carácter bulldog, hernia umbilical, etc. En el laboratorio del Área Genética de la Facultad de Veterinaria nos encontramos desarrollando un Proyecto en el que uno de sus objetivos plantea el estudio de enfermedades monogénicas en bovinos de la raza Holando-Uruguayo. Dentro de las enfermedades hereditarias estudiadas por técnicas de ADN en nuestro País hemos detectado la presencia del gen mutante para la enfermedad BLAD en reproductores de esta raza. Si bien la frecuencia de estos genes mutantes es baja, debemos tener en cuenta que la utilización masiva de determinados reproductores portadores puede incrementarla y así generar importantes perdidas económicas. Por otro lado el conocer si un reproductor esta libre de una enfermedad hereditaria permite desde el punto de vista económico generar un valor agregado a su producto (semen, embriones). Por estos motivos en diversos países se han implementado programas de vigilancia para enfermedades genéticas; de aquí la importancia de divulgar a los colegas veterinarios y productores la utilización e importancia de los marcadores moleculares de ADN en sanidad animal.

Introducción
En la década pasada los avances tecnológicos ocurridos en el campo de la genética molecular y la informática (bioinformática, bancos de genes de dominio publico) han permitido la identificación de genes relacionados con desordenes hereditarios de importancia en el ganado lechero. En la mayoría de los casos la presencia de mutaciones simples en estos genes produce la formación de variantes proteicas no funcionales ocasionando importantes alteraciones en el desarrollo y metabolismo de los animales. En este tipo de alteraciones los animales portadores de variantes génicas mutadas no presentan alteraciones pero si las trasmiten a su descendencia aumentando de esa forma la probabilidad del desarrollo de enfermedades hereditarias con repercusión en el ámbito económico. Debemos tener en cuenta que un toro elite seleccionado como reproductor puede llegar a tener mediante las técnicas de reproducción asistida una descendencia estimada de 10.000 hijos y 100.000 nietos, de aquí se desprende la importancia del control de enfermedades hereditarias.
Las estrategias para él diagnostico genético se pueden clasificar en dos grupos: directas e indirectas. En las directas el marcador molecular utilizado puede ser la identificación de la mutación en el gen asociado a la patología.
Los protocolos de diagnostico directo comprenden los siguientes pasos:
- Extracción de ADN a partir de muestras biológicas (sangre extraída con anticoagulante, semen, tejidos, leche, etc.),
- amplificación (por técnica de PCR) de la secuencia de ADN que contiene el sitio donde ocurre la mutación,
- tratamiento de la secuencia amplificada con la enzima de restricción que cortan la secuencia normal (RFLP)
- electroforesis en geles de agarosa para observación del numero y tamaño de los fragmentos de ADN,
- análisis y genotipado para determinar si el animal es normal, portador o afectado.
El diagnóstico indirecto es independiente del conocimiento del gen implicado en la patología y se fundamenta en la herencia conjunta o estrechamente ligada del marcador molecular de ADN con el gen de interés. En estos casos el marcador molecular puede ser una secuencia repetida polimórfica (microsatélite) realizándose el estudio de cosegregaciòn entre la patología y dicho marcador.
El desarrollo de los mapas genéticos comparativos entre especies ha permitido avanzar en el conocimiento de patologías en mamíferos. En el presente año un total de 1564 genes y secuencias que se expresan (marcadores tipo I) y 349 microsatélites (marcadores tipo II) han sido mapeados en el bovino. La rapidez con que avanza la tecnología genética en este campo ha permitido a investigadores norteamericanos anunciar y difundir la secuenciación completa del genoma de un bovino de raza Hereford.
Enfermedades hereditarias de interés en bovinos de leche:
DUMPS (deficiencia de la enzima uridina-monofostato sintasa): enfermedad hereditaria metabólica que contribuye a aumentar la tasa de retorno al servicio estando dentro de las causas hereditarias del síndrome vaca repetidora de servicio. El gen que codifica para esta enzima se encuentra mapeado en el cromosoma BTA1 del bovino y el cambio de una base nucleotidica (C-T) produce un alelo mutado que genera un codòn stop con terminación prematura de la cadena polipeptídica. Los embriones que heredan los dos alelos mutados carecen de esta enzima y no pueden seguir con su desarrollo normal. Los ancestros identificados como portadores de la enfermedad provienen de dos líneas: Toro Happy-Herd Beautician y Needle-Lane Jon Red.
BLAD (deficiencia en la adhesión leucocitaria bovina): enfermedad hereditaria que contribuye a aumentar la tasa de mortalidad en terneros. Estos mueren entre los 2 a 8 meses de vida con sintomatología clínica inespecífica (enteritis, falta de cicatrización de heridas, neumonías, estomatitis ulcerativas, etc. Existe una baja en las defensas inmunitarias producto de una mutación puntual en el gen CD18. En nuestro País utilizando él diagnostico con marcadores de ADN sobre una muestra de 138 bovinos Holando se encontró que el 7.2% eran portadores de esta patología.
CITRULINEMIA (deficiencia de la enzima argininosuccinato sintasa): Enfermedad recesiva letal metabólica en la cual la falta de esta enzima en doble dosis produce la muerte de los terneros (durante la primer semana de vida) con sintomatología clínica de intoxicación por hiperamonemia y depresión del sistema nervioso. Uno de los toros portadores y diseminadores en la raza Holstein es Linmack Kriss King. El gen que codifica para esta enzima se encuentra mapeado en el cromosoma BTA11 y dicha patología se genera por la presencia de una mutación puntual permitiendo diseñar un diagnostico molecular directo por PCR-RFLP.
En la Figura vemos un gel de agarosa donde en animales homocigotas dominantes (normales) se observan dos bandas despues de realizar el corte con la enzima de restricción (1,2,3,4 color amarillo).

CVM (Complejo de malformación vertebral): Patología hereditaria que se manifiesta con abortos y nacimiento de terneros prematuros (antes del día 260) con alteraciones importantes del desarrollo a nivel de columna vertebral, miembros, malformaciones del tracto digestivo y corazón.
Se observan terneros con fusiones de vértebras, flexión de carpo, enanismo proporcionado.
En este tipo de enfermedades autosómicas recesivas si se cruza un toro portador con una hembra portadora obtenemos el 75% de la progenie normal (25% normal y 50% normal portadora) y un 25% enferma. El estudio de pedigríes permitió conocer que dicha mutación se origino en un toro que es el mismo que trasmitió el BLAD a nivel mundial (7H0543 Carlin-M Ivanhoe Bell BL). Otros reproductores que han contribuido a la diseminación de esta patología son: 7H02236 Emprise Bell Elton BL y Southwind Bell of Bar Lee. El diagnóstico molecular para esta enfermedad se encuentra patentado en Europa y Estados Unidos por laboratorios privados.

Simbología utilizada en los catálogos de reproductores
Enfermedad hereditaria
BL- Portador de BLAD
TL- Libre de BLAD
CV- Portador CVM
TV- Libre de CVM
DP- Portador de DUMPS
TD- Libre de DUMPS
BD- Portador del gen Bulldog
MF- Portador de Pie de mula

BIBLIOGRAFÍA
-Everts-van der Wind, A; et al. (2004). A 1463 Gene cattle-human comparative map with anchor points defined by human genome sequence coordinate. Genome Reseach 14: 1424-1497 (
www.genome.org).
-Llambi, S y Arruga. (2002). Genes, cromosomas y fertilidad en bovinos. Albéitar. 60:36-39 (Publicación para veterinarios y técnicos del sector de animales de producción, España).
-Llambì, S et al. (2003). Frequencia da deficiencia na adesao leucocitaria em uma populacao de bovinos da raca holandesa, no Uruguai. ARS VETERINARIA, Vol. 19, Nº1:52-56.
-Rincón, G. (2002). Aplicación de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) en sanidad, producción y reproducción animal. 41-48. Curso Posgrado Veterinaria-Pedeciba. Facultad de Veterinaria-UdelaR. Dep. Legal 328831.

Direcciones de Internet
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/cow/
http://www.cgd.csiro.au/
http://www.genome.gov/12512900
http://www.holsteinusa.com/
http://www.holsteinworld.com/
Conferencia presentada en Seminario "Leche y Productos lácteos aspectos moleculares y tecnológicos" 4-5 Noviembre 2004- Facultad de Agronomía-UdeLAR-Uruguay

Enfermedad BLAD

Deficiencia en la adhesión leucocitaria bovina (BLAD).

La deficiencia en la adhesión leucocitaria (LAD) ha sido descrita en humanos dentro de las granulocitopatías con reducción de la producción de la ß2 integrina teniendo un origen hereditario (Eskra et al. 1991). En bovinos, el BLAD se describió en el año 1994 por Muller et al., determinándose como una enfermedad autosómica recesiva en la cual los animales homocigotas recesivos mueren a los pocos meses de nacer (2 a 8 meses) con una sintomatología clínica inespecífica. Al nacimiento los terneros afectados son aparentemente sanos pero a las pocas semanas comienzan síntomas de: fiebre alta, diarrea crónica, falta de cicatrización de heridas, gingivitis e infecciones generalizadas. Estas terminan con la muerte del animal, no respondiendo a terapia antibiótica. La enfermedad ha sido también descrita en perros de la raza Setter Irlandés (Trowald-Wigh et al. 1992). En humanos se designa como Leukocyte Adhesión Deficiency (LAD). Esta se comporta como monogénica autosómica recesiva y es causada por la falta o ausencia parcial de una familia de integrinas leucocitarias (Mac-1, LFA-1 y p150,95). Los niños afectados desarrollan infecciones bacterianas recurrentes con leucocitosis persistente. Estos pacientes sin un transplante de médula ósea mueren a temprana edad (Eskra et al. 1991).
A nivel molecular se observó una mutación puntual en el gen CD18 que codifica para una subunidad a proteíca que forma parte del complejo Mac-1 (CD11/CD18) y que a su vez integra el complejo mayor ß2 integrina. Los neutrófilos al presentar la deficiencia de la ß2 integrina estan impedidos de adherirse a los receptores de membranas de los vasos sanguíneos no realizando la diapedesis y la defensa extravascular.
Mediante la secuenciación del ADNc del gen CD18 se pudieron identificar dos mutaciones puntuales cuando se analizaron muestras de bovinos sanos y bovinos enfermos de BLAD.
Una de esas mutaciones es silenciosa y se localizó en la base 775 (CèT) y a nivel proteico el aminoácido que se conserva es la Leucina. La otra mutación que da origen al alelo afectado se produce en el cuarto exón del gen CD18 (Mutación puntual AèG, nucleótido 383), cambiando el Ac.aspártico por la Glicina en la posición 128 de la secuencia protéica, (D128G). Este cambio aminoacídico se realiza en una región altamente conservada del dominio extracelular de la glicoproteína CD18 por lo que se generan dos formas alélicas: D128/D128 (normales); D128G/D128 (portadores heterocigotas) y D128G/D128G (afectados) con lo cual el alelo normal es dominante frente al alelo mutante (Kehrli et al. 1990).
En el año 1992, Shuster et al. desarrollan un método de diagnóstico para detectar animales portadores del alelo afectado mediante la técnica de PCR, amplificando un fragmento del gen CD18 que contiene la zona de la mutación. Posteriormente mediante la utilización de endonucleasas de restricción (E.R) es posible distinguir el RFLP (polimorfismo del largo de los fragmentos de restricción) entre el alelo afectado y el alelo normal, debido a que la mutación provoca la perdida de un sitio Taq I y en su lugar se produce un sitio específico HaeIII.

Esquema de la estrategia de PCR/RFLP para el diagnóstico de BLAD.

Diagnostico de BLAD por PCR
Gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio. Calle 1, marcador de peso molecular, calle 2 y 3 animales heterocigotas (bandas de 159, 109 y 50 pb) , calle 4 animal homocigota dominante (bandas de 109 y 50 pb).

El origen y la difusión de esta enfermedad en los Estados Unidos, se debió a la utilización en centros de inseminación artificial de un excelente toro (Carlin M Ivanhoe Bell).
El pedigrí estudiado por Kerhli et al. (1990) donde se describe la mutación a nivel molecular se remonta por vía materna y paterna a un ancestro común (toro Osborndale Ivanhoe), abuelo paterno del toro Carlin M Ivanhoe Bell.
En el año 1996, la Hoard?s Dairyman de USA publica una lista con toros portadores del BLAD entre los 100 mejores toros americanos: Coldsprings Osado, Dixie-Lee Ivanhoe Henry-ET, Ikenotch Bellor Jack, Schutzs Brass Bell, Liss-Cres-View Jess, Thonyma Secret, Bchnc Bell Benjamín, Clov-Hi Marck Astra Bram, Osborndale Ivanhoe, Penstate Ivanhoe Star, Carlin M Ivanhoe Bell.
Schifferli et al. (2000) describen un método rápido y económico para obtención y transporte de ADN utilizando tarjetas FTA desarrollando de esta manera una metodología sencilla para establecer un nexo directo entre los establecimientos lecheros interesados en conocer el genotipo de sus animales y los laboratorios de diagnóstico. El desarrollo de las técnicas de diagnóstico molecular permitió realizar una selección temprana de los reproductores tendiendo a disminuir la frecuencia del alelo mutante. Mukhopadhyaya et al. (2000) describen un método nuevo donde mediante la técnica de PCR-RFLP crean mutaciones ?in vitro? para generar controles positivos de BLAD (homocigotos recesivos y heterocigotos) a partir de ADN de muestras de bovinos normales. Estos controles son necesarios cuando se deben realizar el genotipado de reproductores y cuando la incidencia de la enfermedad es baja muchas veces es dificultoso la obtención de este material genético. La enfermedad BLAD presenta a nivel mundial una distribución y frecuencia variada. En Uruguay la frecuencia del gen mutado BLAD en una muestra de 138 animales estudiados fue de q=0029 con un 7.2% de animales portadores de la mutación.